ISOLASI DNA, ELEKTROFORESIS GEL, DAN POLYMERASE CHAIN REACTION

ISOLASI DNA, ELEKTROFORESIS GEL, DAN POLYMERASE CHAIN REACTION

Pendahuluan

        DNA dari berbagai organisme bisa diisolasi. Isolasi DNA merupakan teknik dasar dari bioteknologi dan biomolekular yang harus dikuasai di laboratorium. Isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari komponen lainnya seperti lipid, protein, dan polisakarida (Syafaruddin et al. 2011). Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tiga tahapan, yaitu lisis (pemecahan dinding sel), ekstraksi DNA, dan presipitasi DNA. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA total.

            Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif melalui membran matriks gel agarose positif.Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya (Yuwono 2005). PCR adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) serta terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda pada setiap siklusnya (Handoyo et al. 2001). Prinsip dari teknik PCR adalah memperbanyak bagian spesifik dengan enzim DNA polimerase yang diinisiasi oleh pelekatan primer dengan menghubungkan deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) dalam reaksi termal (Raven et al. 2002). 

Tujuan

            Praktikum ini bertujuan mempelajari teknik isolasi DNA untuk mendapatkan DNA yang dapat digunakan sebagai template PCR, mempelajari teknik elektroforesis gel agarose untuk memisahkan fragmen DNA, serta mempelajari teknik amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction. 

Hasil Pengamatan 

Tabel 1 Data konsentrasi DNA hasil PCR 

Pembahasan

            Berdasarkan data yang telah diperoleh dari percobaan terlihat bahwa waktu denaturation, annealing, dan extension mempengaruhi konsentrasi DNA. Terlalu cepat waktu kombinasi siklus menyebabkan tidak terbentuk produk PCR. Sedangkan pada kombinasi waktu kedua terlihat konsentrasi DNA dari hasil PCR. Selain dari waktu kombinasi, konsentrasi DNA juga dipengaruhi oleh suhu annealing dan jumlah siklusnya. Dari hasil pengamatan tersebut dapat disimpulkan bahwa suhu optimal proses annealing yaitu pada suhu 560C. Kemudian dapat disimpulkan pula semakin banyak jumlah siklusnya maka konsentrasi DNA yang dihasilkan semakin banyak sebab terjadi duplikasi jumlah target DNA pada setiap siklusnya. 

Jawaban Pertanyaan

Isolasi DNA 

1. Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses lisis dan pemurnian.pada tahap akhir pemberian buffer TE untuk menjaga DNA terjaga selama penyimpanan (Iqbal et al. 2016). 
2. Campuran buffer lisis dan sampel perlu diinkubasi pada suhu tertentu karena jika suhu terlalu panas maka tidak adanya kemunculan DNA dan dapat merusak DNA, sedangkan jika suhu terlalu rendah maka membran serta jaringan sel tidak dapat hancur. Larutan buffer lisis bekerja dengan optimal pada suhu yang tidak terlalu rendah dan tidak terlalu tinggi (Hariyadi et al. 2018).
3. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation perminute) atau 3000 rpm (Faatih 2009). 
4. Menurut Aristya (2013), pada praktikum ini menggunakan etanol dingin digunakan untuk menyempurnakan presipitasi karena temperatur yang rendah akan menurunkan aktivitas molekul air yang dapat menyebabkan pengendapan DNA lebih efektif. 
5. Setelah tahapan pemberian etanol dingin dan disentrifugasi, DNA terletak pada bagian dasar tabung yang digunakan pada proses supernatant DNA yang dimana DNA yang terpisah dari cairan supernatant dan terletak pada DNA pellet (Hidayat 2015). 

Elektroforesis Gel 

1. Gel agarosa adalah suatu polisakarida yang diekstraksi dari berbagai jenis ganggang merah, atau poliakrilamid yang mampu melakukan separasi DNA dengan kisaran ukuran yang luas. Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Gel Agarosa merupakan polisakarida netral dengan struktur linear dari ulangan unit agarobiosa, yaitu disakarida yang terdiri dari D-Galaktosa dan 3,6-anhidro-L-galaktosa. Agarosa dikenal sebagai fraksi pembentuk gel dari agar karena sifat yang dihasilkannya mendekati sifat-sifat gel ideal yaitu mengandung kadar sulfat yang rendah (<0,7%) serta memiliki kekuatan gel yang tinggi pada konsentrasi rendah. 
2. Larutan buffer berfungsi untuk mempertahankan pH di dalam medium pemisah, dan berfungsi sebagai media penyedia elektrolit pada proses pergerakan aliran listrik. Larutan buffer harus memiliki interaksi dengan molekul yang dipisahkan, dan pH yang digunakan menjadi perhatian sehingga kumpulan molekul dapat dipisahkan satu sama lain tetapi tidak mengalami perubahan struktur. Larutan penyangga harus dipilih dengan cermat, keterkaitan ion buffer dalam berinteraksi dengan senyawa yang diteliti, pH dipilih berdasarkan jenis campuran yang akan dipisahkan. Umumnya pemisahan dapat dicapai pada titik isolistrik (yaitu titik ketika pH suatu makromolekul bermuatan nol akibat bertambahnya atau kehilangan muatan), salah satu senyawa yang dipilih sebaiknya tidak mengakibatkan perubahan kimia atau perubahan struktur molekul yang akan diteliti. Kisaran kekuatan ionik larutan buffer pada 0,05-0,15 mol/L dan biasanya diambil nilai di antara kedua nilai ekstrem. Pada kekuatan ionik yang rendah akan terjadi pergerakan molekul yang cepat dan produksi panas yang rendah, akan tetapi terjadi difusi yang nyata. Di pihak lain, pada kekuatan ionik yang tinggi, diperoleh pitapita yang tajam, namun akan terjadi produksi panas yang lebih tinggi dan terjadi pergerakan molekul pada jarak yang pendek. 
3. Molekul DNA yang bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak (migrasi) ke arah positif (anoda). Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA,baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekulmolekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda). 
4. Keuntungan elektroforesis pada voltase tinggi mengakibatkan pemisahan yang sangat cepat. Sehingga senyawa-senyawa dengan berat molekul rendah akan mengalami proses difusi yang paling baik dipisahkan dalam kondisi elektroforesis tegangan tinggi. Semakin kuat arus listrik yang diberikan akan semakin cepat migrasi DNA. 
5. Rendahnya konsentrasi agarose. Konsentrasi gel agarose sangat mempengaruhi laju migrasi DNA pada proses elektroforesis. Menurut Fatciyah (2011), konsentrasi Agarosa yang digunakan akan menentukan besarnya pori-pori gel yang akan memisahkan-misahkan DNA. Semakin rendah konsentrasi agarose maka matriks gel akan semakin kecil dan fragmen DNA dapat dipisah semakin jauh berdasarkan ukurannya. 
6. DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuran molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil. 

Teknik Polymerase Chain Reaction 

1. Fenomena sel yang ditiru oleh teknik PCR yaitu proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif. PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). 
2. DNA target dari template DNA menggunakan DNA polimerase yang akan diamplifikasi. Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. 
3. Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA (Handoyo et al. 2001). Rancangan primer yang kurang baik menyebabkan reaksi PCR tidak bekerja dengan baik sehingga menyebabkan produk PCR yang tidak spesifik dan atau terbentuknya primer dimer. Perancangan primer dapat dilakukan dengan membuat desain menggunakan software “primer3”. 
4. Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim ini harus bersifat termostabil. 
5. Denaturasi (pemisahan) untai ganda DNA merupakan langkah yang kritis selama proses PCR. Temperatur yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan untai ganda DNA. Temperatur pada tahap denaturasi pada kisaran 92-95ºC selama 15 detik, suhu 94ºC merupakan pilihan standar. Sedangkan pemanjangan primer-primer melalui sintesis DNA pada suhu 68°C selama 30 detik (Joko et al. 2011). 
6. 
   
   
7. Pada proses denaturasi, dua utas DNA dipisahkan secara fisik dengan suhu tinggi dan kemudian pada proses selanjutnya yaitu annealing suhu diturunkan untuk memfasilitasi penempelan DNA polymerase secara spesifik pada untai tunggal DNA yang sudah berkomplementasi dengan primer. 
8. Ketika suhu denaturasi 50°C, tidak terbentuk produk PCR karena pada proses denaturasi merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Suhu juga menentukan keberhasilan proses ini dalam PCR dan suhu yang pas dalam proses denaturasi ini 93-95°C. Sedangkan, jika suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi DNA template tidak sempurna. 
9. Terdapat beberapa faktor yang dapat menentukan tingkat keberhasilan teknik amplifikasi DNA menggunakan PCR. Faktor- faktor itu antara lain deoksiribonukleotida triphosphate (dNTP); oligonukleotida primer; DNA cetakan (template); komposisi larutan buffer; jumlah siklus reaksi; enzim yang digunakan; dan faktor teknis dan non-teknis lainnya, seperti kontaminasi. 
10. Kondisi PCR optimum yang didapatkan, seperti initial denaturation pada suhu 94°C selama 3 menit diikuti dengan 30 siklus terdiri dari denaturation pada suhu 94°C selama 30 detik, annealing pada suhu 60°C selama 30 detik, dan extension pada suhu 70°C selama 25 detik; kemudian diakhiri dengan final extension pada suhu 72°C selama 5 menit. Kondisi ini memenuhi parameter spesifisitas dan reprodusibilitas pada validasi metode analisis. 

Simpulan

           Teknik isolasi DNA menggunakan prinsip memecah dan mengekstraksi jaringan sehingga terbentuk template DNA. Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran fragmen dengan bantuan gel agarose. Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) memiliki tiga tahapan yaitu: denaturation (pemisahan utas DNA), annealing (penempelan primer oligonukleotida pada bagian DNA sekuen homolognya) dan extension (pembentukan utas DNA baru berdasarkan template DNA dari setiap utas). 

Daftar Pustaka

Faatih M. 2009. Isolasi dan sigesti DNA kromosom. Jurnal Penelitian Sains dan Teknologi. [diakses             2021 Okt 27]; 10(1): 61-67. http://digilib.unmuhjember.ac.id/files/disk1/38/umj-1x-ariindrian-                1896-1-3.arii-a.pdf. 

Handoyo, D, Rudiretna A. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan polimerase chain reaction (PCR).                 Unitas. [diakses 2021 Okt 27]; 9(1):17-29. http://repository.ubaya.ac.id/35/. 

Hariyadi S, Narulita E, Rais MA. 2018. Perbandingan metode lisis jaringan hewan dalam proses isolasi             DNA genom pada organ liver tikus putih (Rattus norvegicus). Proceeding Biology Education                 Conference. 15(1): 689-692. https://jurnal.uns.ac.id/prosbi/article/view/33046. 

Iqbal M, Buwono DI, Kurniawati N. 2016. Analisis perbandingan metode isolasi DNA untuk deteksi                 white spot syndrome virus (WSSV) pada udang vaname (Litopenaeus vannamei). Jurnal                         Perikanan Kelautan. [diakses 2021 Okt 27]; 7(1):54-65.                                                                             https://jurnal.unpad.ac.id/jpk/article/download/13941/6688. 

Joko T, Kusumandari N, Hartono S. 2011. Optimasi metode PCR untuk deteksi Pectobacterium                         carotovorum, penyebab penyakit busuk lunak anggrek. Jurnal Perlindungan Tanaman                             Indonesia. [diakses 2021 Okt 27]; 17(2):54-59.                                                                                         https://media.neliti.com/media/publications/196543-ID-optimasi-metode-pcr-untuk deteksi-                   pectob.pdf. 

Sinaga A, Putri PAL, Bangun KM. 2017. Analisis pola pita andaliman berdasarkan primer OPD 03,                     OPD 20, OPC 07, OPM 20, OPN 09. Jurnal Agroteknologi FP USU. [diakses 2021 Okt 27];                 5(1):55-64. https://media.neliti.com/media/publications/109236-ID analisis-pola-pita-                            andaliman-zanthoxylum.pdf. 

Syafaruddin, Randriani E, Santoso JT. 2011. Efektivitas dan efisiensi Teknik isolasi dan purifikasi DNA             pada jambu mete. [diakses 2021 Okt 27]; 2(2):151-159.                                                                             https://media.neliti.com/media/publications/141601-ID-efektivitas-dan-efisiensi teknik-                        isolasi.pdf. 

Yustina PD, Yustiantara PS, dan Narayani I. 2018. Teknik perancangan primer untuk sekuen gen Mdr-1             varian 1199 pada sampel buffy coat pasien anak dengan LLA. Jurnal Metamorfosa. [diakses                 2021 Okt 27]; 5(1):105-111.                                                                                                                         https://ojs.unud.ac.id/index.php/metamorfosa/article/download/38861/23524. 

Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga. 

Yuwono T. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.